Utvikle metoder for å analysere og differensiere somatiske celler i geitemelk ved bruk av flowcytometri

Geitemelkproduksjon har lange tradisjoner i Norge, med tradisjonsrike produkter som brunost, og med potensial for nye produkter som løpe- og syrekoagulerte oster. Men somatisk celletall (SCC) er uvanlig høyt i norsk geitemelk. SCC er forbundet med bakterielt og enzymatisk innhold i melka og kvalitetsforringelse ved osteproduksjon. Høyt SCC vitner om subkliniske jurinfeksjoner, som kan kreve antibiotikabehandling, til skade for miljø og folkehelse, og til hinder for omlegging til økologisk produksjon.

SCC omfatter ulike leukocytter, en del av immunforsvaret. Ulike bakterier vil gi ulike immunresponser i juret, lite kartlagt hos geit. Celletall brukes rutinemessig som kvalitetsparameter, men samsvar mellom celletall og faktisk kvalitet av melka er mangelfullt. Ensidig fokusering på celletall betyr å rette fokus mot en immunmekanisme hos dyret. Det trengs derfor kunnskap om hvilke celler som finnes i melka, og sammenheng mellom disse og nærvær av enzymer og bakterier.

Prosjektet skal differensiere celletallet i geitemelk ned på spesifikke undergrupper av leukocytter ved hjelp av flowcytometri. En veletablert teknikk, og anvendelse på melk er dokumentert fra andre arter. Metoden vil danner grunnlag for studier av sammenheng mellom bestemte leukocytter, enzymer og bakterier, og kan lede til mer presise mål for kvalitet og avl i norsk geitehold. 

Somatiske celler fra melk og blod hos geit og ku ble vellykket isolert og protokoll ble skrevet. Protokollen kan brukes til celleanalyser, deriblant flowcytometri og cellesortering. En utfordring er at celletallet varierer stortmellom dyr, men 50ml melk ble funnet tilstrekkelig til formålet. «Gating»-strategier (hvordan ulike cellepopulasjoner gjenkjennes i flowcytometeret) ble satt opp basert på blodceller, på bakgrunn av kjente reagenser, og adaptert til melkeprøver. Disse resultatene ga grunnlag for videre flow-analyser beskrevet nedenfor.

Et av delmålene i prosjektet var å komme fram til egnede protokoller og paneler som kan benyttes til screening av somatiske celler hos geiter i etterfølgende undersøkelser. Litteratur ble studert for å kartlegge tidligere kunnskap om lignende studier hos geit og ku, for å finne fram til kryssreagerende antistoffer og andre hensiktsmessige reagenser til dette bruk. Både hos geit (lite dokumentert) og hos ku (bedre dokumentert) kansomatiske celler forventes å bestå av granulocytterogmakrofager/monocytter, mens lymfocytter og epitelceller i mindre grad bidrar til det somatiske celletallet. Særlig granulocytter knyttes til bakteriell jurbetennelse. I tillegg kan man hos geiter (ikke ku) forvente at SCC også inkluderer cytoplasmatiske legemer som mest sannsynlig stammer fra epitelceller. Disse antas å ikke knytte seg til betennelse i juret, men det foreligger lite kunnskap om dette hos geiter. Et viktig mål var derfor å kunne skille ut makrofager fra granulocytter og lymfocytter, samt cytoplasmatiske (DNA-frie/fattige) cellelignende legemer. Fordi døde celler er en betydeligkilde til feil i analysene, var det også et viktig mål å finne en anvendbar levende/død markør. For å kunne kjøre gjennom større prøvematerialer, må alle parametre kunne kombineres i samme prøve(multiplekses). En utfordring er at få reagenser finnes til geit og ku, og selv om de fungerer enkeltvis. Når antistoffer er av samme underklasse (isotype) er de ikke uten videre kompatible i slik multipleksing. Problemet kan delvis avhjelpes ved å selv konjugere antistoffer med fluorokrom (målbart fargestoff).

Prosjektet har gitt tre hovedresultater:
1.Etablert protokoll som kan brukes til isolering av leukocytter fra 50ml melk inntil 48 timer etter prøvetaking.
2.Etablert kombinert panel og tilhørende protokoll for innfarging med reagenser som kan skille de vesentligste celletypene i melk hos geit og ku i en enkelt prøvebrønn: Immunceller vs. andre (epitel)celler, granulocytter, makrofager/monocytter og lymfocytter, cytoplasmatiske legemer, levende vs. døde celler.
3.Gjennomført sammenlignende pilotstudie med ovennevnte panel på en serie geitemelksprøver med høye og lave celletall (SCC). Foreløpige funn har ikke avslørt tydelige korrelasjoner mellom SCC-tallet og bestemte cellepopulasjoner målt i flowcytometri. Studier i en større populasjon vil kreves.

Subsidiære resultater:
4.Testet ut to typer reagenser for diskriminering av levende og døde celler, hvorav den ene (Fixable Live/Dead) er tatt med i panelet (2.) over.Et stort antall av cellene i melka ble markert som døde, en feilkilde som dermed kan elimineres.
5.Testet utDNA-fargingerav celler med sikte på å identifisere DNA-frie cytoplasmatiske legemer, tatt med i panelet.DNA fargingen viserogså stadium i celledelingen (av uviss betydningfor formålet).
6.Testet ut strategierfor granulocytter, makrofagerog monocytter. Disse er medi panelet.
7.Testet ut strategierfor mer detaljerte undersøkelser av lymfocytter. Disse ville imidlertid gjortanalysene mer komplekse, er ikke essensielle for prosjektmålene, og utelates frapanelet.
8.Testet en del antistoffer og reagenser som er funnet uegnet/ikke kryssreaktivt med celler hos geit og/eller ku, eventuelt ikke praktisk brukbart i sammenheng med analysepanelet over.
9.Konjugert antistoffer (bearbeidet reagenset for å passe til panelet) der dette har vært nødvendig.
10.Testet ut kombinasjon av alle ønskede parametre i samme prøve (multipleksing).

Oppsummert har dette resultert i ferdige protokoller og paneler egnet for å undersøke større prøveserier for de mest sannsynlige hypotesene som kan ligge bakdifferensiell sammensetning av somatiske celler i norsk geitemelk.

Et annet delmål var å bruke en nyinnkjøpt avansert cellesorterer for å isolere helt spesifikke cellepopulasjoner fra melk. Metoden forutsetter veletablerte paneler for leukocytt-identifisering i flowcytometri, som beskrevet i forrige delmål. Med denne tilleggsmetoden ville enkeltcellepopulasjoner kunne utforskes i nærmere detalj, slik som genuttrykksanalyser med PCR.

Instrumentet har vist seg svært krevende å operere, og har vært beheftet med mange oppstartsproblemer. Cellesortereren er nå i delvis drift etter lange utsettelser. Vi har kommet noe i gang med sortering av blodceller og melk, og funnet at instrumentet er kompatibelt med flowcytometri- strategien som er har laget. Prosjektet har imidlertid ikke kommet i mål med å sortere celler i renkultur. Slike celleisoleringer er imidlertid ikke essensielle for å besvare hovedproblemstillingen (differensiell celleanalyse i flowcytometri, som beskrevet ovenfor).

Samarbeidsprosjekt "High somatic cell numbers in goat milk –influence on product quality" ble ble innvilget av FFL/JA høsten 2020 (NFR 320834). Prosjektet startet opp i 2021 og skal måle celletall (SCC) hos norske geiter under ulike driftsforhold, bl.a. ved beiteslipp på fjellet.